荧光检测分析的主要原理以及使用方法

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荧光现象是由西班牙医生和植物学家N. Monardes在1575年第一次发现并记录的。后来科研人员陆续发现一些发荧光的材料和溶液，到19世纪末，人们已经知道了600种以上能发荧光的化合物。这期间，科研人员逐步认识到从激发态回跳到基态的发射光波长比吸收的或者入射的光稍长。20世纪以来，荧光现象得到较为广泛的研究，例如，共振荧光和增感荧光的发现、荧光的定量分析、荧光产率的测定以及荧光寿命的直接测定等。随着学科的交叉和各学科的迅速发展，纳米材料和技术、激光等光学、电子学和微电子器件等新技术的引入，荧光检测在理论和应用方面得到了很大程度上的进展。

下面我们就了解一下荧光检测分析：

什么是荧光？

某些物质受光照射激发能发射比激发光波长更长的光。此物质能从外界吸收储存能量(如光能、化学能等)，并进入激发态；当其从激发态再回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射(即发光)，称为荧光。

(荧光）

知道什么是荧光后就很容易了解荧光分析

荧光分析是指利用某些物质被紫外光照射后处于激发态，激发态分子经历一个碰撞及发射的去激发过程所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。由于有些物质本身不发射荧光（或荧光很弱），这就需要把不发射荧光的物质转化成能发射荧光的物质。例如用某些试剂（如荧光染料），使其与不发射荧光的物质生成络合物，各种络合物能发射荧光，再进行测定。因此荧光试剂的使用，对一些原来不发荧光的无机物质和有机物质进行荧光分析打开了大门，扩展了分析的范围。

（荧光光路图）

上海滨赛光电提供的Vortran Laser Technology公司的Stradus系列半导体激光器专门应用于荧光检测方面的应用，Stradus采用独家专利密封模块化技术，此系列激光器具有7*24小时连续工作稳定性，保证市场上最高的24小时0.5%的工作稳定性.

（Vortran公司激光器）

激光器功率稳定性：

激光器光束质量：

荧光检测的使用方法：

流式技术：

优点是速度快，非常适合做大数量统计，且样品只被检测一次，完全不用担心荧光淬灭的问题。缺点是只能检测荧光的有无、强度大小，无法提供空间定位信息，无法做荧光定位变化的实验；由于样品只被检测一次，因此无法对同一个样品进行连续观察。例如，做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号，但是用显微镜却看不到东西，排除仪器和滤光片选择问题，很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。

荧光显微镜：

刚好与流式互补，可很好地进行空间观察，判断目标蛋白的定位，但是不适合做大流量检测，估计没人能经得起时间的考验。有不同倍率的物镜选择，可以使用高倍物镜看精细结构，或用小倍率物镜做少量统计。与之搭配的CCD和软件，是系统能否发挥性能的关键。尤其是CCD，从那么多商品里选一款合适的不容易，需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。

共聚焦：

荧光显微镜的升级产品，具有很好的光学层切效果，能得到很好三维定位信息。但是，如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照，取得一张好看的图片，就让人觉得可惜了。共聚焦基本都是全自动系统，可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。另外，4Pi和STED又是其中的极品，具有超高的空间分辨率，只是使用不方便，未必适合做生物实验。

全内反射:

荧光显微镜的另一种升级产品，属于近场光学范畴，只适合且最适合做膜研究，无法看到胞内信息。也是用CCD成像，但是对CCD的要求更高——个人甚至觉得对CCD的要求是没有上限的。